在這里，我們介紹TwistAmp®液體，一種新的PCR替代形式，使RPA技術(shù)更適用于廣泛的研究應用。與PCR擴增相比，RPA只需幾分鐘，而不是幾個(gè)小時(shí)，可以運行不需要額外設備。TwistAmp®Liquid Basic和Basic試劑盒可用于需要良好保真度，凝膠電泳或固相檢測的應用。TwistAmp®Liquid exo和exo允許快速實(shí)時(shí)擴增和檢測目標而不犧牲靈敏度或特異性。

概述

      圖1:RPA循環(huán)，重組酶蛋白與引物形成重組絲，并將其插入DNA雙螺旋的互補位點(diǎn)，形成d環(huán)。單鏈dna結合(SSB)蛋白穩定雙螺旋結構和d環(huán)的開(kāi)放。重組酶的分解允許鏈置換聚合酶沿著(zhù)目標序列延伸引物的3端。當對相反的引物重復這個(gè)序列時(shí)，指數擴增發(fā)生而不需要熱變性或退火。

      自2008年推出以來(lái)，TwistAmp®試劑盒為科學(xué)家提供了一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)進(jìn)行重組酶聚合酶擴增(RPA)，迄今為止已有250多篇關(guān)于該技術(shù)的同行評審出版物。RPA是一種等溫替代聚合酶鏈反應(PCR)的方法，它使用三種蛋白質(zhì)(重組酶，單鏈dna結合蛋白和鏈置換聚合酶)來(lái)代替熱循環(huán)(圖1)。RPA在恒定低溫下(理想情況下為37-42°C)效果，反應速度非?？?反應時(shí)間小于20分鐘)，可以用穩定的凍干顆粒啟動(dòng)，這使得它非常適合即時(shí)測試。此外，RPA用戶(hù)已經(jīng)在各種不同的應用中測試了TwistAmp®試劑盒試劑，包括那些傳統上使用PCR的試劑(如最近對RPA應用的回顧所述1)。與PCR一樣，簡(jiǎn)單的RPA使用兩種相反的引物以指數方式擴增DNA的特定區域。RPA引物對遵循與PCR引物相似的設計規則，并且為PCR反應開(kāi)發(fā)的引物通常在RPA反應中表現良好。

關(guān)于TwistAmp®Liquid試劑盒

     為了鼓勵這種多為了鼓勵這種多用途的RPA技術(shù)，TwistDx™開(kāi)發(fā)并推出了TwistAmp®液體試劑盒，為用戶(hù)提供更靈活的試劑。TwistAmp®Liquid試劑盒類(lèi)似于在每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗室冷凍室中發(fā)現的預制PCR master mixes，包括核心RPA蛋白混合物的甘油儲存管，一管緩沖液，一管驅動(dòng)重組過(guò)程所需的能量混合物和一管用于蛋白質(zhì)的醋酸鎂輔助因子。

      有四種TwistAmp®液體試劑盒可用:基本和基本RT擴增無(wú)探針，適用于凝膠電泳，固相擴增和微陣列應用與尾部引物和適配體;exo和exo RT，它們與基于探針的實(shí)時(shí)檢測方法兼容。所有四個(gè)試劑盒包含相同的核心反應混合物，重組酶，單鏈結合蛋白和鏈置換聚合酶的比例與凍干的TwistAmp®基本試劑盒相同。因此，當使用液體試劑盒時(shí)，使用凍干的TwistAmp®基本試劑盒進(jìn)行的分析當然應該表現得非常相似，但使用其他凍干的TwistAmp®試劑盒進(jìn)行的分析在使用液體試劑盒時(shí)可能會(huì )顯示出不同的分析性能。圖2顯示：使用TwistAmp®exo RT和TwistAmp®Liquid exo RT進(jìn)行的檢測均檢測到50份人呼吸道合胞病毒B RNA模板。除了Core Reaction Mix外，exo試劑盒還包含一管外切酶III，用于處理TwistAmp®外切酶探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，RT試劑盒包含一管逆轉錄酶，用于將RNA單步轉化為cDNA并隨后擴增。

     TwistAmp®液體試劑盒，類(lèi)似于他們的凍干對應試劑盒，配制允許擴增片段高達500個(gè)堿基對的大小，這足以用于許多常見(jiàn)的PCR實(shí)驗室用途(不同的蛋白質(zhì)制劑正在開(kāi)發(fā)，以允許更長(cháng)的擴增子)。這使得RPA成為許多標準實(shí)驗室克隆和測序方案中取代PCR的優(yōu)秀候選者。當用于Illumina下一代測序文庫制備時(shí)，RPA比校對聚合酶(如Kapa HiFi和Platinum pfx2)導致的錯誤更少。此外，在為合成生物學(xué)開(kāi)發(fā)的端到端自動(dòng)化微流控平臺上，利用Gibson克隆的等溫變體，RPA已被用于生成更長(cháng)的754堿基對片段，從而證明了在已建立的聚焦pcr方案中成功實(shí)施RPA。

TwistAmp®Liquid試劑盒優(yōu)勢

      與凍干的TwistAmp®試劑盒相比，TwistAmp®Liquid的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是，科學(xué)家可以根據需要使用盡可能多或盡可能少的TwistAmp®試劑，在他們選擇的容器中進(jìn)行反應。與PCR不同的是，RPA是等溫的，在相對較低的最佳溫度下工作，并且可以耐受過(guò)低溫度和溫度波動(dòng)。在將主混合物輸送到反應體系之前不需要預熱，并且在較低的等溫溫度下，蒸發(fā)和冷凝的影響不是主要問(wèn)題。這意味著(zhù)在小的、分區的微流體裝置體積中的熱控制得到了簡(jiǎn)化:RPA已被證明可以在非常小的(皮升)體積中工作4。RPA的這些屬性也意味著(zhù)它可以用于比PCR理想的更大體積的反應。圖3顯示：一對PCR引物5成功擴增了淋病奈瑟菌269堿基對片段，反應量為2.5 ~ 5000微升。因此，TwistAmp®液體反應可以在從定制的微流體裝置到標準實(shí)驗室96孔板到微離心管，甚至更大的容器中運行。

選擇TwistAmp®液體試劑盒而不是凍干TwistAmp®試劑盒的科學(xué)家有更多的選擇性，因為T(mén)wistAmp®液體試劑盒不包括脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)。因此，可以用三磷酸脫氧尿苷(dUTP)或標記的核苷酸進(jìn)行檢測，以允許擴增子捕獲或比色或電化學(xué)檢測6 - 8。

總結

RPA已在250多項外部研究中得到應用，并在眾多應用和領(lǐng)域中越來(lái)越具有優(yōu)勢。我們的新型TwistAmp®液體是實(shí)驗室分子生物學(xué)研究中第一個(gè)可行的PCR替代品。

1. Lobato, I.M. & O’Sullivan, C.K. Trends Analyt. Chem. 98, 19–35 (2018).

2. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).

3. Linshiz, G. et al. J. Biol. Eng. 10, 3 (2016).

4. Li, Z. et al. PLoS One 11, e0153359 (2016).

5. Sachdev, D., Patel, A.L., Sonkar, S.C., Kumari, I. & Saluja, D. Biomed Res. Int. 2015,

597432 (2015).

6. Koo, K.M., Wee, E.J. & Trau, M. Theranostics 6, 1415–1424 (2016).

7. Wee, E.J., Ngo, T.H. & Trau, M. Clin. Epigenetics 7, 65 (2015).

8. Lau, H.Y. et al. Sci. Rep. 7, 38896 (2017). 

默瑞生物

默瑞(上海)生物科技有限公司，作為專(zhuān)業(yè)的生命科學(xué)產(chǎn)品推廣與服務(wù)商，以“創(chuàng )新，專(zhuān)業(yè)，共贏(yíng)"的理念，不斷強化服務(wù)體系，提升客戶(hù)體驗，結合國內外優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品提供高標準完整解決方案，幫助科研客戶(hù)和生物技術(shù)企業(yè)高效創(chuàng )新，加速轉化，創(chuàng )造更多優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，提升社會(huì )福祉，實(shí)現多方共贏(yíng)。

默瑞生物創(chuàng )立以來(lái),已經(jīng)陸續導入TwistDx,enzymatics,KAPA BIOSYSTEMS,BioDynami,Jackson,Echelon,ChromoTek,Nanocs,Biotechrabbit,Lee Biosolutions, magtivio,美的醫療冰箱,新華醫療,FOUR E'S科學(xué)儀器等優(yōu)質(zhì)國際品牌，逐步培育成為專(zhuān)業(yè)用戶(hù)的選擇。

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